Ричард Робертс рассказал о том, что такое бактериальная метилома

Ричард Робертс рассказал о том, что такое бактериальная метилома

В рамках Московского фестиваля науки в МГУ прошла лекция сэра Ричарда Робертса – знаменитого британского биохимика и молекулярного биолога, открывшего интроны в эукариотической ДНК и механизм сплайсинга. Вместе с Филлипом Шарпом он получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1993 году "За открытие, независимо друг от друга, прерывистой структуры гена". Лекция, которую он прочел в МГУ, называется "Бактериальные метиломы: сложный технический термин, который легко объяснить". Онлайн-трансляцию лекции провело сетевое издание M24.ru.

Ведущий: Для меня большая честь представить Ричарда Робертса, лауреата Нобелевской премии 1993 года. Ричард Робертс получил Нобелевскую премию за то, что секвенировал геном и генетический код. Предполагалось, что такой код ДНК существует, потому что у ДНК генетическая функция состоит из четырех базовых элементов и 20 аминокислот. Поэтому предполагалось, что есть генетический код. Однако непрерывная природа не была в то время доказана. Доктор Ричард Робертс тоже долгое время бился над доказательной базой своих результатов. И самое замечательное, что он доказал себе и всему миру, что это оказалось так. Это было основное достижение, которое наградили Нобелевской премией.

Но Ричард, скорее, – доктор в области биоорганической химии, и свою докторскую работу он делал именно в области химии, изучая тропические растения. Потом он работал в области молекулярной биологии, выпустил целый ряд книг. В то время, в 90-е, весь мир был восхищен молекулярной биологией, очень ею интересовался. В общем, доктор продолжал свою научную карьеру в Гарварде, но химические принципы и подходы к науке он сохранил до сих пор. Доктор Робертс считает, что для того чтобы понимать функцию молекулы, прежде всего, надо понимать ее структуру.

Его следующая постдокторская работа была направлена на изучение последовательности ДНК, метилтрансферазы ДНК. Он работал в одной из лучших лабораторий мира, где исследовал секвенирование генома аденовируса. Секвенирование генома аденовируса было важнейшим достижением его жизни, надо сказать.

Далее доктор начал исследовать нуклеотиды и энзимы и для этого применял всю технику, которая изначально использовалась для изучения однородных молекул. Доктор произвел революционные исследования в молекулярной биологии. И это, конечно, был ключевой этап для генной инженерии, и это позволило начать более глубинное изучение вирусов ДНК. Доктор Робертс начал исследовать эти энзимы и другие ограничивающие энзимы. Это были очень ценные исследования. Многие ученые вышли из лаборатории доктора Робертса и тоже исследовали энзимы, с которыми можно работать. Биотехнологические компании стали интересоваться этими ограниченными энзимами, стали воспроизводить их и продавать. Ричард основал свою компанию, где работал в качестве научного консультанта. Позже эта компания выросла, и у нее создался собственный научный отдел. Его знания по ограниченным энзимам поспособствовали основанию лаборатории, финансировала ее технологическая компания, которая сегодня является одной из ведущих компаний в области биомолекулярного производства. В общем, и все, что я смог сказать вкратце о Ричарде Робертсе. Сегодня это не только доктор Ричард Робертс, но и сэр Ричард Робертс. Этот почетный титул ему вручили в Великобритании. А теперь я приглашаю доктора Робертса к презентации, и он расскажет нам о бактериальных метиломах сам. Пожалуйста.

Ричард Робертс: Доброе утро, дорогие друзья. Я хочу поговорить с вами о том, что вы, наверное, не очень хорошо знаете, это довольно интересная тема. Это та сфера, которая, я убежден, послужит основой для множества открытий. Я надеюсь, что некоторые из них буду делать я, потому что очень интересно делать научные открытия, поверьте мне. Но я буду также счастлив, если одним из открывателей-ученых будете вы. Я надеюсь, в течение нашего разговора вы поймете, что бактерии – очень интересный материал для изучения, они очень важны. Мы не знаем о них столько, сколько должны знать. И если вы хотите понять, как сократить расходы на здравоохранение, то бактерии предоставляют прекрасную возможность для этого процесса.

Давайте посмотрим на этот слайд. Он показывает вам следующее. Если посмотреть на человеческий организм, у нас много клеток. Но если посчитать бактериальные клетки на вашей коже, волосах и везде, каждую человеческую клетку сопровождают 10-12 бактериальных клеток. Интересно, что если мы убьем все бактериальные клетки, то вы умрете, вы не сможете жить без них. Они очень важны по целому ряду причин. И только недавно мы начали интересоваться воздействием бактерий на здоровье человека.

Я думаю, что все, кто был на лекции доктора цур Хаузена вчера, знают, что некоторые из этих бактерий могут вызвать рак. Меньше известен тот факт, что некоторые из этих бактерий могут остановить рост раковых клеток. По бактериям интересно еще то, что они сделали нас, наши тела, своим жилищем.

Если вы пойдете и станете где-то жить, первое, что вы захотите сделать, – это защитить свой дом против воров, против пожаров, против любых неприятностей. Бактерии делают то же самое в нашем организме. Мы – их дом, и они не хотят, чтобы с нами что-то плохое происходило. Они не хотят, чтобы в этот дом пришли инфекции, болезни. Во многих случаях они находят способ остановить патогенные бактерии от роста и развития и находят способ предотвратить также раковые клетки от роста, не все, но некоторые. И могу сказать, мы не знаем, как они это делают, это полностью неизученная зона. Это то, что стоит исследования, потому что если мы сможем понять, как они могут нас защищать, то мы можем применить эти знания в медицине. Поэтому все это очень-очень интересно.

В основном все ваши клетки одинаковые, но бактерий гораздо больше, свыше 20 тысяч, кто-то пару лет назад сказал мне, 50 тысяч штаммов, но мы не знаем, сколько их точно, потому что мы только стали исследовать и понимать, что это такое. Я хочу еще сказать, что бактерии, которые живут в вас всех, отличаются. У каждого человека бактерии отличаются, многие из них совпадают, но есть индивидуальные особенности, и эти особенности отражают тот факт, что у вас, как у людей, разные человеческие гены. Если посмотреть на базы ДНК, то вы увидите вдвое-втрое больше генных базисов в бактериях, чем у человека. Но если посмотреть на гены, количество генетических элементов: у человека где-то 25 тысяч генов или чуть меньше, но бактериальных генов свыше миллиона, может быть, 10 миллионов. Очень много генов в бактериях, которые, мы не знаем, чем они занимаются. Мы тратим очень много денег, для того чтобы составить последовательность ДНК, но мы не тратим ничего, чтобы узнать, что делают эти гены бактерий.

Вы, наверное, знаете слово "эпигенетический". Если посмотреть на человеческие клетки, то там происходит очень много метиляции и ситоцина. Многие гены проявляются в процессе метилирования, то есть они моделируются. Некоторые гены, которые вы унаследовали от матери, могут не проявляться, но унаследованные от отца гены могут проявляться, потому что они проявляются в этой метилированной группе. Мы знаем, что эти генетические модификации связаны с заболеванием. Например, в случае рака очень часто повышенный уровень метилирования ДНК, в некоторых случаях метилирование пониженное, но это очень часто серьезный маркер для видов рака или унаследованных генетических заболеваний. Поэтому людям очень интересно это, они пытаются понять, как этот механизм происходит и можно ли использовать его для диагностики в медицинских центрах? Однако выясняется, что бактерии также занимаются метилированием, у них больше метилирования происходит, чем у нас, у людей, и они тоже делают эпигенетику, но мы практически ничего об этом не знаем. Именно поэтому я говорю, очень много открытий предстоит сделать в этой области, чтобы понять, что происходит во время метилирования в этих бактериях. Надо понимать, что бактерии старее, чем мы. Мы – новички на этой планете по сравнению с бактериями, им больше 3 миллиардов лет, но в целом бактерии очень умны, они понимают, как делать все интересно и по-умному, чтобы они оставались в живых, чтобы мы оставались в живых, и чтобы происходила история эволюции, как она происходит. Это означает, что если они и делают эту генетику, то они делают это гораздо сложнее и умнее, чем мы, люди. Именно поэтому сложная задача – разгадать этот ребус.

Мы знаем кое-что о метилировании. Исследования последовали после обнаружения ограничивающих энзимов, именно после этого открытия я заинтересовался метилированием среди бактерий. Ограничивающие энзимы, которые мы открыли, мы начали изучать их в 1968 году с ученым Арбером, который открыл первый рестрикционный энзим, рестрикционный фермент. Он обнаружил рестрикционные ферменты, но он открыл один очень полезный и провел работу, которая послужила открытию других ферментов и стала революцией в области биотехнологий. Без этих ферментов не случилось бы биотехнологической революции в начале 70-х. А человек справа – это в некотором роде самый интересный персонаж из этих трех ученых, потому что когда Арбер и Хэмильтон Смит работали, они не имели понятия, для чего использовать эти энзимы. Это были любопытные биологи. Но потом их очень хороший друг, ученый Смит понял, для чего они используются. Он понял, что можно разложить, как на карте, ДНК и расшифровать его. Именно поэтому я заинтересовался, потому что я слушал лекцию господина Дэна Натанса, в которой он показывал, что можно взять большой кусок ДНК и разрезать его на отдельные маленькие кусочки. Я подумал, что это будет основой, на которой можно будет разработать метод последовательности ДНК, потому что каждый раз, когда ты хочешь разрабатывать метод, тебе нужны начальные, реперные точки, и надо начинать с малого. Вы не сможете расшифровать всю последовательность ДНК, не разбив перед этим их на небольшие элементы, потому что при разработке метода надо также убедиться в его правильности.

Последовательность можно получить несколькими способами и узнать, что вы правы. Это очень важно в науке в целом. Не только в плане того, когда вы разрабатываете новый метод, но и когда вы проверяете свои результаты на достоверность. Вы должны знать, что вопросы, которые вы задаете, имеют правильные ответы. Позвольте вам рассказать о рестрикционных ферментах. Рестрикция – это феномен, который наблюдался в бактериях в 50-х. А группа ученых, исследующих их, заметили, что когда небольшие вирусы-бактерии пытаются расти, очень часто они не растут, но иногда одна или две из них растут. Они продолжают расти, инфицируют штаммы очень хорошо, создают много себе подобных. Почему они в основном не могут расти? Из-за рестрикционного фермента, потому что он перерезает ниточку ДНК, как только возникает последовательность ДНК.

Конечно, у бактерии есть своя собственная ДНК, так почему бактерии свою собственную ДНК не перерезают? Потому что у них есть система защиты. У них минииммунная система внутри бактерий. Это достигается медитилированием, которое лежит в основе распознавания рестрикционных энзимов. Именно по этой причине они не перерезают свои собственные ДНК. То есть в жизни эти два энзима – вирусный и бактериальный – конкурируют друг с другом. Вирусная бактерия проникает и пытается метилировать, а рестрикционный фермент перерезать ее. Но очень часто метилаты оказываются резистентными и, таким образом, объясняется феномен рестрикции. Это несовершенная иммунная система, это просто ограничения, это рестрикция, которая не позволяет вирусу расти. Я изучил эти ферменты с самого начала 1972 года, мы пытались обнаружить новые и описать те, которые известны. Создали большую базу данных, она называется Rebase, в ней очень много информации по рестрикиционным ферментам, но там также рассказано и о тех ферментах, в метилизаторах, которые способствуют процессу метилирования и идут параллельно с ферментами. Это послужило основой индустрии биотехнологий.

Очень долгое время никто этим не занимался. Некоторые ученые пытались разгадать последовательность, исследовать ее, однако мы знаем, что метилаза ДНК является частью рестрикционно-модификационной системы. То есть вы можете найти гены и в рестрикционных ферментах, потому что они в геноме, а геномы соседствуют друг с другом. Некоторые из них показывают ограничивающую деятельность. Вы, наверное, знаете, что метилаза может контролировать репликацию кишечной палочки, и поэтому кишечная палочка не размножается. Есть пример одной из бактерий, которая немного отличается в контроле бактериального цикла, и эти метилазы мониторят в том числе и эту бактерию.

Однако мы многого не знаем. О большинстве метилаз мы не имеем никакого понятия, зачем они и что они делают, если они не являются частью этой рестрикционно-модификационной системы. Я полагаю, а также многие ученые думают, что они поддерживают эпигенетический феномен. То есть внутри бактерии проходят процессы, о которых мы до сих пор не знаем. Но в течение этой лекции вы увидите, что есть очень много метилирования, которое происходит внутри бактерии, не имеющего ничего общего с рестрикцией. Поэтому что это такое, что они делают? Именно поэтому я стал биологом, а не физиком, потому что физики работают в области физики, а в биологии мы мало что знаем и вынуждены делать много открытий практически в каждой системе, которую мы анализируем. Мы существуем в идеальной сфере: каждый может проводить любые исследования, делать открытия, но много не знает, что там происходит. Это хорошо, конечно, должны быть новые интересные вещи, которые еще предстоит открыть.

Что касается ДНК метилазы, она распознается в конкретной последовательности ДНК и метилирует эти специфические последовательности. Есть примеры белков, в которых заинтересованы многие биологи, которые признают специфические последовательности ДНК. Вы, наверное, знаете, что почти каждый, кто изучает более высокие, высшие организмы, они заинтересованы в транскрипционных факторах. Вы знаете, этот ген производится, не производится, и эти факторы нужно каждый раз выяснять. Мы очень мало знаем, как эти транскрипционные факторы распознают ДНК, но мы знаем, что очень многие другие белки распознаются ДНК, но мы точно не знаем, как этот процесс распознавания осуществляется. То же самое происходит с ДНК метилазы. Они не смотрят, как другие белки, не выясняют, но распознают соответствующую последовательность ДНК.

Хотел бы немного рассказать о трех видах метилирования. Их мы обнаружили в бактериях. С – это то, что находится сверху, это то самое метилирование. М6 – метиловая группа. Они повсеместны, имеются у всех бактерий. 90-99% всех бактерий это делают. Есть также третья форма и здесь она показана – М4 – это внешняя группа, не так распространена, ее можно обнаружить только в бактериях, больше нигде. Это три своего рода метилирования. Прежде чем я пойду дальше, я хотел бы показать вам один очень интересный способ, как именно метилтрансфераза с ДНК взаимодействует. В 1991 году мы подумали, что было бы интересно кристаллическую структуру проанализировать метилтрансферазы ДНК и посмотреть, как она специфическое распознавание осуществляет. Мы начали этот проект и исследовали несколько метилтрансфераз ДНК, но не могли получить кристалл. Кристаллы довольно сложно иногда получить. В 1992 году мы, наконец, получили несколько кристаллов, но белок не связывался с ДНК, они сами по себе существовали, но было интересно. И в 1993 году, примерно через два месяца, когда мне надо было ехать в Стокгольм, для того чтобы получить нобелевскую премию, тогда я и получил ее, мы сделали большое открытие – мы обнаружили, как именно метилтрансфераза ДНК связывается с ДНК механизмом, который здесь показан, при переворачивании. Когда трансфераза связывается с ДНК, происходит переворачивание базы ДНК. Если вы посмотрите сюда, то желтым показана база, основа, как бы хребет ДНК, а здесь одна база, которая перевернулась. Почему? Потому что очень трудно для белков со спиралью связаться. И ферменты просто перевернулись на активную сторону белка, и произошла химическая связь. Мы хотим знать, что подавляющее большинство белков реализуют с ДНК тот же самый механизм. Подобным образом эксперименты, которые открывают спираль ДНК и так же используют этот метод путем переворачивания полимеразы ДНК, и, возможно, вам будет интересно знать, что первый шаг в полимеризации РНК, мы не знаем, как это происходит, нет представления, никто никогда не изучал кристаллическую структуру, мой прогноз, что именно так это происходит, путем переворачивания. Как только база переворачивается у ДНК, гораздо легче получить своего рода раскрытие спирали. И нужно посмотреть на картинку, для того чтобы получить представление об этом. Вот пример – невероятно удачно я оказался в своей жизни, я в течение часа мог бы говорить, как мне повезло, но это лишь один пример. И когда вы получаете Нобелевскую премию, вы приезжаете в Стокгольм и читаете лекцию. Большинство людей читают такую лекцию и рассказывают все замечательное, что они проделали, чтобы получить эту премию.

Я, в частности, работал в той области, где сделал свое открытие, в течение 10 лет, до получения премии мне было интересно, о чем же мне говорить. И что же? Я неожиданно такое большое открытие сделал, и мне было о чем говорить на этой лекции. Я думаю, что вы оцените, когда вы делаете открытие, то лучшее место, где о нем сообщать, это в Стокгольме при получении Нобелевской премии. Вы никогда не знаете, когда это произойдет. У меня нет необходимости, чтобы получать еще одну такую премию.

Я хотел поговорить о том, как метилаза распознает специфическую последовательность. Если мы посмотрим сюда, вот организация генов различных рестрикционных систем. Сверху системы первого типа. Здесь трехгенная система, которая отвечает за рестрикционную ДНК. Желтым цветом – отвечает за распознавание последовательности ДНК, голубым цветом – отвечает за метилирование. Но суть дела здесь в том, что распознавание последовательности при таком С-подразделении. Это то, на чем нужно сосредоточиться, для того чтобы работать, подумать, как происходит процесс распознавания. Мы пока еще не имеем ни единой кристаллической структуры. Мы ранее много работы проделали, но думаем, что, наверное, надо начинать ее.

Для того чтобы метилировать ДНК, нужно два гена – S и М. S связывается с ДНК, а М потом проводит метилирование. Для того чтобы реструктировать ДНК, нужны все три гена, но это несколько сложно выглядит. Это очень большой, очень сложный ген, но что расстраивает, что рецессионный фермент случайным образом связывается, даже если связывается в очень специфичную последовательность, тем не менее, щели образуются, и поэтому оказывается очень трудно работать, чтобы произвести, распознать последовательности первого вида, потому что единственным образом, как вы можете сделать, это посмотреть, что все метиловые группы, и попытаться найти согласие, то есть консенсус последовательностей, что-то общее последовательностей, где будут располагаться все атомы. Это довольно просто. В одном из проектов, если бы я пришел к вам и сказал кому-то: "Вот проект, почему бы его не осуществить?" Он может сказать: "Да, хорошо, было бы неплохо поработать над системой распознавания последовательности". Потом он почитает литературу, поговорит со своими коллегами-студентами, может три-четыре месяца понадобиться, чтобы это осуществить. Может быть, вы сможете мне еще один проект предложить, но некоторые не очень и заинтересованы в этом.

Системы второго вида отличаются, они имеют два гена, каждый код по каждому белку и каждый распознает последовательность, который разрезает и метилирует. Поэтому есть два отдельных блока, и каждый распознает уже сами последовательности. При той же последовательности мы всегда предполагали, что этого могло и не произойти, то есть метилаза метилирует собственно базу систем распознавания фермента, защищает ее, но она необязательно должна быть такой по сути.

До недавнего времени мы совершенно не знали, что это будет то же самое или нет, и возник вопрос, позднее я к нему еще обращусь. Ферменты третьего вида имеют свойства, которые являются промежуточными между первым и вторым видами. Они распознают специфические последовательности, используют подъединицу М-метилазы, для того чтобы ресептировать ген, который должен связаться с метилазой, потому что метилаза имеет специфичность.
Здесь, для того чтобы определить специфичность, система третьего типа или первого типа, всегда оказывается очень трудным работать над последовательностью распознавания ДНК метилазы. И относительно недавно мы не знали, как это делается. Затем появился новый метод. Я не могу переоценить, насколько важно, когда появляются новые методы в исследованиях. Почти всякий раз, когда вы изобретаете новый способ, вы никогда не ожидаете, какой может быть результат. Вот почему хорошо, когда у вас возникают какие-то вопросы. Мы должны думать, а какие новые методы могут быть, необязательно результаты, полученные старыми методами. Это интеллектуальный метод последовательности. Я покажу вам, как это действует. Но ключевой момент: появились две публикации в 2009-м и 2010-м. Публикация, которая появилась в 2010-м, она упоминала конкретно, что помимо работы над ACGNT, они работали так же, где была метилаза. Ни одна предыдущая технология секвенирования не могла этого обеспечить. А этот момент говорит, как именно модифицируется база. Когда я увидел эту публикацию, я был действительно возбужден, впечатлен. Я сказал: "Давайте эксперименты проведем вместе с биоинженерами". И в результате сотрудничества мы достигли определяющего результата. Вот хорошая публикация, которая обобщает то, что происходит, и в каком направлении все идет. Очень полезно прочитать, рекомендую.

Суть этого метода. В сущности, то, что показано наверху, это полимераза ДНК, которая связана с B, и однониточную ДНК вы подаете, и полимераза начинает добавлять еще одну базу одновременно, то есть это полимераза. Она очень аутогенерирована серьезно, мутировала, и она включает ACGNT, в сущности, при равной скорости. Не так, что это попадает в базу с самого начала, анализ показал, спектроскопия, но это копирует модифицированную базу, затем разрыв, возникает замедление. Если компилировать в метилированную базу, в базу метилазы, то несколько больше времени нужно, чем при обычной базе. Поскольку это молекулярная техника, можно лазер использовать, можно посмотреть, сколько времени займет, для того чтобы добавить еще одну базу. Таким образом, если вы копируете долгое время, вы поймете, где база метилазы есть. Если посмотреть подробно, здесь вы видите прямо справа внизу оранжевую базу. Здесь происходит измерение того времени, которое необходимо, для того чтобы копировать, тиражировать эту конкретную базу. Вы здесь получаете очень четкий сигнал, таким образом, вы поймете, где цитозины, как они модифицируются. Этот метод выглядит действительно доброкачественным, и программное обеспечение используется, конечно, для того чтобы интерпретировать все сигналы, чтобы узнать, где именно происходит метилирование. Поэтому самая первая вещь, которую я предложил в New England в США – у нас было большое количество трансгенов, трансферазы, метилазы, очень сильная кишечная палочка – мы проверяли, метилирование не происходило. Если этот клонированный ген конвертировать и трансферазу использовать, тогда метилирование происходит априори с одним геном, и будет то же самое. Мы начинали с того, чтобы примерно 10-20 их проанализировали и уже знали ответ, потому что знали сам метод, знали, какая база модифицировалась. Возникает вопрос, дает ли это метод правильный ответ? Да, получается, что пока только он. Подытоживая, я хотел бы сказать после 9-10 месяцев работы: да, всякий раз мы получали точные ответы. Этот метод впечатляет. Это значит, что можно начинать исследовать те гены, о которых до сих пор не знали, какая именно последовательность распознавания там осуществлялась.

На следующем слайде, здесь, наверху, вы видите, фермент ITT распознается, он модифицирует, и модифицировался один из A-генов. Мы знали, что здесь есть последовательность распознавания, но не знали, какая именно. Как только мы провели анализ PAI, после этого по этой оранжевой базе мы поняли, что внутренняя часть модифицировала, но не внешняя. В случае нижней части, то, что здесь указано в области A, или 2CIZ, те, которые модифицировалась в последовательности распознавания, но опять же мы не знаем, оказывается, что биоинформатика позволяет дифференцировать метилирование C, XC-генов, и осуществляется это подобным образом. Когда back-анализ провели, остаточный А модифицировался в фермент, это было очень интересно.

Давайте теперь посмотрим на что-то более сложное. И следующая вещь, которую мы посмотрели, – это система третьего типа. Я хотел бы напомнить, что система третьего типа касается специфичности, которая здесь кодирована. Смотрим на систему первого типа, и тоже специфичность здесь кодируется. Если посмотреть на систему третьего вида, первое, что мы проанализировали – мы не знали, какая база модифицировалась, и не знали, какая последовательность распознавания была, и это был очень хороший тест – посмотреть, потому что действительно метод работал. Если здесь посмотреть, то, что график Sequence показывает, он показывает две нити ДНК, внутренний круг – это одна нить, внешний – другая нить. Здесь у нас всегда метка. Метка везде, где происходит метилирование с одной конкретной нити, не на двух нитях. Мы знали, что это было абсолютно типично для ферментов типа три, потому что все они должны быть охарактеризованы, и мы только метилирование однониточное наблюдали. И всего лишь несколько мест, которые мы здесь видим, очень хорошая последовательность распознавания, потому что везде разные были сигналы, очень было хорошо. Тем не менее, мы знали, какие последовательности распознавания, то есть мы первого вида систему проанализировали, хорошо протипировали.

Может быть, мы можем и клонировать гены, поработать над этим? Почему весь геном не проанализировать и поработать с ним? Благодаря биоинформатике и благодаря тому, что очень была полная последовательность генома, мы взяли несколько, очень мало, генов метилазы. Идея была такая: если взять только одну, то неестественно много групп метилазы было бы, и тогда можно было поработать со всем геномом и выяснить, какая последовательность распознавания. Мы выбрали где-то половину десятка таких генов. Здесь хромохилобактер, гены бактерии, и взяли систему RM, здесь она, это типичная система. Я уже говорил о трех генах со специфичностью.

Здесь, внизу, две метилазы, о которых, мы даже не думали, как именно соответствующая респекция фермента могла происходить, но мы могли прогноз делать хотя бы по одному из них. Когда мы посмотрели на метилирование метилазы, какие могли быть последовательности, мы обнаружили здесь, например, системы первого типа, и мы знали, что это тип один, потому что система типа один имеет очень интересное свойство: то, что там двусторонняя система распознавания через действие, три-четыре базы здесь. Поэтому это упрощает возможность увидеть их, и более широкие данные получить. Мы знали, что это было точным, идя сюда, мы не знали, какой из этих генов будет отвечать за эту последовательность, и выяснилось, что именно этот, и затем мы клонировали все гены. И поэтому все эти шесть геномов, на которые мы смотрели, они, в общем-то, доказали, что наши предположения были правильными.

Вот это те шесть геномов, группа типа 1 ферментов, несколько типа 2, типа 3, 27 метил-трансфазеров и 13 новых специфик. Я хочу сказать, что половина метилазы, которую мы обнаружили, – это то, что мы ранее не видели никогда. Это было больше, чем мы ожидали, мы не ожидали увидеть такой диапазон разнообразия. Вы увидите, по мере того, как мы будем продвигаться дальше, что это очень нетипично. Одновременно с этим мы работали с биоучеными в группе, из группы ученых Гарварда и еще из группы ученых из больницы. Мы смотрели на штаммы кишечной палочки, содержащейся в шпинате, которые способствовали возникновению гемолитического и уремического синдрома, и поэтому мы сделали метиломный анализ этой палочки, этой бактерии, и мы обнаружили, что очень много рестрикционных ферментов там есть.

Я хочу привлечь ваше внимание на пару вещей, которые очень интересны по этому штамму. В этой колонке TY-2482 – это компоненты рестрикционной системы, которую мы видели в метилазе. В MG 1655 это то, что мы обнаружили в обычной кишечной палочке, которую мы вырастили в лаборатории. Это та последовательность, которую мы можем делать с помощью нашего лабораторного инструментария. Вы увидели, что этот патогенный штамм имеет гораздо больше метилазы, чем обычный штамм. Две из них особенно нам интересны: Ego G1, Ego G2 – это метилазы, которые метилировали в CA резидуалы. А это плазмиды, которые кодированы в энзиме, зашифрованы в энзиме, я расскажу вам о них попозже. Обычные кишечные палочки, которые мы вырастили в лаборатории, имеют целый ряд метил-зависимых систем. Это системы, которые "отрезают" ДНК только тогда, когда ДНК метилирует, то есть, это останавливает различные агенты, активные вещества, от проникновения бактерий. И вот эти метил-зависимые системы мы увидели. Таким образом, мы могли извлечь очень много ДНК из штаммов, которые хотелось бы, чтобы не размножались, и мы увидели, что различные патогенные бактерии проникали туда, и их не останавливали вот эти метил-зависимые системы. Мы знаем сейчас, что это очень типичный параметр у многих патогенов, они теряют вот эту метил-зависимость. Это график, который показывает метилирование всех резидуалов, и вы видите, что группа А метилировала. В основном, такая типичная картина у нас получилась.

Еще одна интересная вещь – это другой фермент, о котором я говорил, это плазмин, он называется EgoGIX. На этом кольцевом графике вы видите, что только один из них метилировал, но не сильно, чуть-чуть. И случайно мы обнаружили еще один плазмин, с подобными ферментами для вида Burkholderia cenocepacia. Мы должны задаться вопросом, почему один штамм метилирует, а другой нет? Учитывая то, что небольшая специфика в этих двух случаях. Самый легкий способ думать об этом – это понять, а как репликация происходит? Вы знаете, что когда реплицируете ДНК, две нити реплицируются немножко иначе. Сначала делаете одну, а потом, чуть позже, другую. И поэтому, если метилтрансфераз, метилопередача тоже связана с лабораторным инструментарием, и мы делаем репликацию одним за другим, это может объяснить то, почему вы интерпретируете…

Позвольте мне вернуться к слайду, который я вам показывал ранее. Мы расшифровывали метилазу. Сейчас это трехмерная модель гипотезы, которую мы проверяем на прочность. То есть, при очищении фермента из кишечной палочки, если мы возьмем полимеризацию, то антитела не позволят нам это сделать. Это очень типичная картина во многих плазмидах, и, я думаю, что это связано с репликацией. Если это так, то это позволит нам показывать две различные фазы при репликации. Это те метилазы, которые были обнаружены недавно.

С 1970 года до, примерно, 2011 года было очень сложно понимать последовательность рекогниции. Сегодня с развитием бионауки, биотехнологии очень легко стало определять, и вы видите, как график у нас стремительно пошел вверх – это тип 1 и тип 3 метилтрансферазы, о которых мы ранее не имели понятия. Сегодня у нас есть данные свыше 600 геномов, которые мы уже проанализировали. Хочу сказать, что когда вы видите кривую не контурную, а непрерывную, то это параметры метилазы, которые мы обнаружили, а контурная кривая означает, что мы еще в процессе их изучения. И я думаю, что это займет некоторое время, мы должны использовать биоинформационный анализ, клонирование мы не будем использовать часто, я думаю, что периодически, конечно, придется воспользоваться этим, но не часто.

Это тип один. Это системы, которые представляют собой очень интересный феномен. Они выглядит так: три гена, но потом мы обнаружили, что есть четыре гена, потому что этот ген метилировал и превратился в два. И посмотрите, последовательность у нас ССС, потом тип прерывается, потом у нас идет TTT-RTGY. Когда у вас есть вариант метилирования или нет, как показано в правой части графика, перед Т можете иметь BBA, потому что все системы типа 1 используют эту расшифровку. То есть, вы не можете защитить ее с помощью А, и в данном случае данная система использует метил С для защиты. Мы впервые обнаружили это, ранее это не было известно.
Здесь вы видите кое-что другое по архитектуре построения этой системы. Эти подъединицы, которые мы назвали TRD-1, TRD-2 – это домены распознавания один и два. Один из них распознает левую сторону последовательности, другой – правую сторону последовательности. Есть очень много вариаций, которые мы увидели в этих последовательностях, включая начало и конец. Внутреннее строение иногда специфичное. Есть субмотивы, которые могут быть совершенно разными и неожиданными. У нас были примеры последовательных двух, трех и четырех TRD. Это тот случай, когда вы можете распознать и увидеть две-три последовательности и далее, концовка вариации интересна. В буквальном смысле слова могут быть сотни тысяч последовательностей типа 1. Анализируя это, мы хотели бы выработать общие правила распознавания и, может быть, в будущем мы сможем это сделать. Итак, что мы узнали до сих пор? Мы узнали, что очень много отдельных метилаз, которые не имеют рестрикционных ферментов. Что они делают? Вы скажете, что это странно, но, тем не менее, это так. Их очень много, и мы не знаем, что они делают. Есть гораздо больше вариабельности в распознавании последовательности, чем мы думали ранее.

Когда мы начинали этот проект, далее мы выработали последовательности по 100, по 200 системам, мы думали, что мы выработаем общие правила и принципы, которые будут применимы к остальным, но пока это не так. Мы также обнаружили, что тип 2 метилтрансферазы соответствует довольно специфичной, и есть ферменты, которые распознает GAATTC последовательность. Если А метилирует и блокируется, то у вас есть метилаза, которая работает по AATT, она заблокирует также и все остальные последовательности. Почему же природа делает это? Когда мы смотрим, мы видим практически точное соответствие между последовательностью распознавания метилазы и последовательностью распознавания фермента. Это говорит нам о том, что происходит некоторая селекция, некоторый выбор, который мы до конца не понимаем. Один из вариантов, в пользу которого я сейчас склоняюсь, состоит в том, что если вы делаете больше метилазы, чем необходимо, вы, таким образом, вмешиваетесь в нормальный ход действия других метилатов. Может быть, это влечет за собой больше метилирования, чем то необходимо по биологическим причинам.

Мы также обнаружили очень много профагов, которые интегрированы в геном, и они содержат неспецифичные метилазы. EgoG One, который я вам показывал, он закодирован на уровне профага. И вот этот бактериофаг выходит из хромосомы, он метилирует все и потом возвращается обратно. То есть это способ самозащиты. Есть очень много, буквально, тысячи профагов, в которых закодирована метилаза.

Также надо поговорить о методе пак био-чередования. Это замечательный метод, и люди только-только начинают ценить его по достоинству. С моей точки зрения, конечно, интересно то, что это единственный способ вычисления последовательности метилазы. И это относительно простая техника для этого действия. Таким образом, мы сможем узнать, какие метилированные гены активны, и можно сформировать функциональную аннотацию метил генов метилазы. Также метод pacbio позволяет нам читать примерно 20 тысяч элементов последовательности. Если смотреть на другие методы вычисления последовательности, они дают вам возможность сделать 200-300 последовательностей, и очень сложно замкнуть цепь, чтобы вычислить весь геном. Но если ваш весь геном состоит из двадцати длинных отрезков, то очень легко их сочетать вместе, вычислить их от начала до конца, используя метод pacbio.

И последнее – это точность последовательности, которая значительно улучшена, это то, что многие люди не осознают при использовании метода pacbio, потому что происходит следующее. Допустим, я делаю вычисление последовательности нескольких килобаз, и я совершаю несколько ошибок. Далее я делаю итерации несколько раз, 50-100 раз, и те ошибки, которые были сделаны впервые, они в хаотичном порядке у меня происходят, и статистически вы можете посмотреть на заключительный отрезок последовательности и вычислить точно секвенирование. Возникают при секвенировании системные ошибки, и есть вероятность того, что вы будете повторять одну и ту же ошибку снова и снова. Именно поэтому данные при определении очень многих человеческих полиморфинов оказались неправильными из-за статистических ошибок. Это было показано, когда мы переделали, заново сделали этот метод, используя pacbio, который помогает избежать таких статистических погрешностей.

В заключение хочу отдать дань уважения людям, с которыми я провел огромный объем работы. Это моя исследовательская группа: Иен Марри, Брайан Антон – они делают всю рутинную работу, а я сижу перед компьютером и играю с последовательностями. Тайсон Кларк и Йонес Колрадж – они работают в лаборатории Pacific Biosciences. Потрясающее сотрудничество с ними было, мои слова благодарности им. Мэтью Боудер, Мэтт Блоу из JJI, геномного института, они делали очень много расшифровок последовательностей генома, и очень многие данные мы получали у них и использовали в своих публикациях. Также институт Broad, а также Малайский институт в лице Имунды и, конечно, другие ученые, которые показаны здесь. Есть очень много и других людей, которые работают над методом biopac, над инструментарием, потом отсылают нам данные. Это очень просто, потому что мы собираем это все в одно целое, благодаря специальной программе. Это самая интересная область науки, и было очень интересно в этой области работать. Мы до сих пор уверены в том, что метилаза, метилирование – это процесс до конца не изученный, во многом не изученный, я хочу сказать. Я чувствую это, чувствую, что стоит этим заниматься, и много открытий еще предстоит. Спасибо за внимание.

Ведущий: Большое спасибо за прекрасную лекцию. Пожалуйста, вопросы.

Ричард Робертс: У нас есть штамм кишечной палочки, и мы изучили его метилированные гены, он растет немного медленнее. Но надо понимать, что когда вы делаете эксперименты в лаборатории, вы, может быть, не отражаете те условия, которые существуют в реальном мире. Иногда случайно вы натыкаетесь на что-то и понимаете, как все происходит, но во многих случаях вы не имеете понятия. Например, в случае кишечной палочки есть метилаза, которая чередуется как ATGC с AT, и никогда в лаборатории с кишечной палочкой мы ее не получали. Она очень хорошо сохраняется, во всех кишечных палочках присутствует, но в лабораторных условиях мы не знали, как ее задействовать. Мы знаем, что если вы производите ее в лаборатории, в плазмиде, то вы при увеличенных условиях, не сможете продемонстрировать это. В случае с сальмонеллой тот же самый ген проявляется каждый, каждый раз. Там вы видите много-много метилен с одним и тем же геном.

Иногда очень сложно получить точные экспериментальные условия в лаборатории, которые бы соответствовали реальным условиям жизни, поэтому мы работаем с несколькими группами, с исследователями из Китая, смотрим на стрептомицеты. Они очень интересный цикл развития проходят между ростом. И мы знаем, что там есть изменения параметров метилирования, они там происходят и, может быть, там происходит не один феномен, а несколько процессов одновременно. Мы рассматриваем ряд различных систем, и поэтому еще раз хочу сказать, что иногда реальные условия отличаются от лабораторных.

Люди, которые пытаются разрабатывать антибиотики, помимо всего прочего, в Японии изучают эти паттерны, в целом они не работают. Есть некоторые противораковые медикаменты, которые нацелены на метилцитозин, они по некоторым раковым клеткам хорошо работают, их убивают, но сегодня не так много препаратов, которые нацелены на эти клетки. Проблема в том, что каждый раз, когда противораковую клетку, противораковый препарат вы вырабатываете, вы пытаетесь сделать так, чтобы он был нацелен на все раковые клетки. Интересно было бы, если были бы различия в параметрах метилирования в человеческих клетках, чтобы эти препараты были нацелены на конкретные узкие цели. На сегодняшний день параметры метилирования в человеческом организме очень разные, нет простой системы распознавания всех типов бактерий. Но я надеюсь, что мы сможем тонко настраивать и убивать только те бактерии, которые надо убивать, и оставлять в живых те, которые надо оставлять путем постижения метилирования.

- В ряде случаев метилирование специфическое цитозина неполным оказывается в бактериальном геноме, может быть, 95%, что-то в этом районе. Как вы можете пояснить, почему не происходит он в полном объеме?

Ричард Робертс: Наблюдение такое, что не все циты распознаются. Есть несколько объяснений этого. Когда мы обычно готовим ДНК, то не все клетки в одном и том же положении находятся, когда они реплицируются со временем, иногда вы видите одну не деметилированную, а другую нет, потому что метилаза как бы не поймала. Но мы очень много примеров знаем, когда одна нить метилируется, а другая нет. Также и случаи, когда факторы транскрипции очень тесно связываются с ДНК, и это предупреждает метилирование, потому что метилирование – это постреплицированное событие, постреплекативное. Несколько случаев этого мы наблюдали. Но мы проанализировали очень много штаммов этой кишечной палочки и наблюдали общее место, которое никогда не метилируется. Может быть, два таких можно найти в других местах, что не все метилируется. Но ни одного цита мы не находили, ни одного места, который был неметилированный. В других организмах несколько лучше выглядит. Конечно, есть некоторые другие места в организме, циты, которые не метилируются и, может быть, фактор транскрипции, связывания не так себя вел. Но мы наблюдали то, что не во всей генетической работе, которую мы проделали, мы не так много времени посвятили исследованию бактерий, потому что финансовые агентства и руководители решили, что люди гораздо более интересны, с точки зрения, чем бактерии. Поэтому много инвестировали именно в изучение человеческого генома. Они в прошлом не давали больше денег на такого рода бактериальные исследования и микробиологию. Хотя национальный институт человеческого генома, институт здравоохранения говорит, что макробиогеном интересен, и они стали инвестировать в это. Может быть, со временем ситуация изменится и на бактериальные исследования больше будут давать денег.

- Вопрос касается метилазы, которая выглядит как будто, может быть, она участвует в реплицировании каким-то образом. Как именно?

Ричард Робертс: Если бы изначально это была метилаза, то она метилировала бы все вокруг и переворачивала бы базу ДНК. Затем, каким-то образом она сходство получила с полимеразой ДНК. Может быть, это объяснит, как именно они соединяются, хотя выяснилось, что метилирование не столь важным было. Потому что полностью метилирование не проходило и постепенно потеряло свои способности работать как метилаза, но вместо этого стала больше связь спирального характера. Поэтому мы хотели протестировать, действительно хеликаза образуется, и хорошо ли спираль формируется. Я думаю, это очень интересно в отношении эволюции, никто не скажет, вы правы или не правы. В большинстве случаев какое-то объяснение появляется, и люди начинают, может быть, верить. Но я думаю, что в этом случае у нас есть возможность биохимию реализовать, чтобы посмотреть, как она работает. На этом над этим мы сейчас работаем.

- Я хотел бы поблагодарить лектора. Неокриотические и эпигенетика, эти клетки – они обычно связаны с процессом дифференцирования и самостоятельными решениями. Генетическая система бактерий, ее функция в чем?

Ричард Робертс: Сама идея, дело в том в новых кариотах метилирование очень часто связано с развитием, может быть, это основная функция новых кариотов. Я думаю, что это не единственная их функция. Есть много примеров, когда изменения с транскрипцией происходят во взрослых клетках, разных видах клеток, но есть определенная роль в плане модулирования транскрипции. У бактерий некоторые бактерии, да, дифференцируют.
Что касается crescentus, например, миксокок – очень много есть таких бактерий, которые осуществляют дифференциацию. Может быть, метилирование участвует в этом процессе, так же, как с стрептомицином. Вот почему выбрали стрептомицин, нити ДНК, чтобы стрептомицин изучить, я не знаю, что происходит. Я хотел бы знать это все и сказать бы вам суть дела. Есть хорошая публикация, которая все рассказывает, но вы подумайте об этом. Ваша очередь.

Ведущий: Еще раз большое спасибо за интересную тему.